A cystinuria metabolikus következményei BMC Nephrology Full Text
Absztrakt
Háttér
A cystinuria a vese aminosav transzportjának örökletes rendellenessége, amely visszatérő nephrolithiázt és jelentős morbiditást okoz az emberekben. Világszerte világszerte 7000-ből 1 fordul elő, így ez az egyik leggyakoribb genetikai rendellenesség az emberben. Fenotípusosan jellemeztük az A típusú cystinuria egérmodelljét, amely a Slc3a1.
Mód
Kiesése Slc3a1 RNS és fehérje szinteken valós idejű kvantitatív PCR és immunfluoreszcencia alkalmazásával értékeltük. Slc3a1 a kieső egereket normál vagy tenyésztő chow étrendre helyezték, és a röntgensugár-analízis beindításával értékelték a cisztin kő képződését az idő múlásával, valamint a vesekárosodás kialakulását a sérülés biomarkereinek mérésével. A vesekárosodást szövettani elemzéssel is értékelték. Az aminosavszinteket az egerek vérében nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával mértük. A máj glutation szintjét lumineszcencia alapú vizsgálattal mértük.
Eredmények
Megerősítettük a Slc3a1 az RNS szintjén, míg Slc7a9 A társ-transzportert képviselő RNS megmaradt. A várakozásoknak megfelelően megfigyeltük a hólyagkövek képződését Slc3a1 -/- egerek. Férfi Slc3a1 - - - az egerek súlya kisebb, mint a Slc3a1 +/+ . Slc3a1 A rendszeres étrendben lévő -/- egereknél a vér karbamid-nitrogénje (BUN) emelkedett, a szérum kreatininszint emelkedése nélkül. Azonban, ha a kieső állatokat tenyésztő chow-étrendre helyezzük, amely magasabb cisztin-koncentrációt tartalmaz, mind a BUN, mind a kreatinin szintjének emelkedése a súlyosabb krónikus vesebetegségre utal. A szövettani vizsgálat kimutatta, hogy ezek az étrendi hatások súlyosbodtak a vese tubuláris obstrukciójában és az intersticiális gyulladásban, valamint a húgyhólyag gyulladásában. A cisztin a glutation antioxidáns molekula előfutára, ezért értékeltük a glutation szintjét a Slc3a1 -/- egerek. Mind a redukált, mind a teljes glutation szintjét szignifikánsan alacsonyabb szinten találtuk a kiütéses állatokban.
Következtetések
Eredményeink arra utalnak, hogy az étrend befolyásolhatja a krónikus vesebetegség kialakulását és progresszióját a cystinuria állatmodelljében, amelynek fontos következményei lehetnek a betegségben szenvedő betegek számára. Ezenkívül a redukált glutation hajlamosíthatja a cystinuriában szenvedőket az oxidatív stressz okozta sérülésekre.
Háttér
Létrehoztuk az I típusú cystinuria egérmodelljeit. Peters és mtsai. missense mutációt azonosított Slc3a1 N-etil-N-nitrozo-karbamid (ENU) mutagenezis szűrőn C3HeB/FeJ egerekben [8]. A szerzők csökkent vese súlyt mutattak ki a homozigóta hímeknél, összehasonlítva a vad típusú hímekkel és a homozigóta nőstényekkel. Ezenkívül a plazma karbamid szintje megemelkedett a 13-20 hetes homozigóta hímeknél, összehasonlítva a vad típusú állatokkal. Livrozet és mtsai. spontán mutációt azonosított Slc3a1 129SvPasCrl egereknél cystinuria következett be [9]. A szérum kreatinin mérésekkel mérve a mutáns egerekben a vesefunkció nem romlott szignifikánsan. Megfigyelték azonban a megnövekedett makrofágokat és az interstitialis fibrózist a mutáns egerekben. Ercolani és mtsai. kimutatta a hólyag kivezetésének elzáródását hím cystinuria egerekben vegyes C57Bl/6 és 129/SvJ háttereken [10]. Beszámoltak e cisztinuria egérvonal generálásának genetikai stratégiájáról [11]; ennek a cisztinuria egér törzsnek a teljesebb jellemzésére törekedtünk.
Mód
Állatok
Slc3a1 -/- és vad típusú (hím és nőstény) egereket tenyésztettek és tartottak fent a fent leírtak szerint, a Nashville Tennessee Valley Healthcare System VA és a Vanderbilt University Medical Center intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága szerint [10, 11]. A normál és tenyésztő chow étrendeket a Lab Diet-től (St. Louis, MO) szereztük be, a normálnak megfelelő 5L0D, a tenyésztőnek pedig az 5LJ5 értékkel. Az egereket a Nashville Tennessee Valley Healthcare System VA-ban helyezték el. A tömeg és a hosszúság mérését egereken végeztük, amelyeket tenyésztő chow-n tenyésztettek és tartottak fenn. A hosszúság mérésére az egereket izofluránnal altattuk és az orr hegyétől a farok hegyéig mértük. Az állatokat véletlenszerűen csoportosítottuk kísérleti csoportokba. A vizsgálat végén az állatokat az American Veterinary Medical Association szerint CO2 gázzal, majd méhnyak elmozdulásával eutanizálták.
Valós idejű-PCR
Az egérszöveteket eltávolítottuk és RNAlaterbe (Qiagen, Valancia, CA) merítettük az mRNS expressziós vizsgálatokhoz. Az RNS-t Qiagen RNeasy Kit alkalmazásával extraháltuk. Az alapozó párokat a Primer Express szoftver (Applied Biosystems, Foster City, CA) alkalmazásával terveztük meg, és endogén kontrollként a GAPDH expressziót alkalmaztuk. A mRNS expressziós szintje Slc3a1 és Slc7a9 kvantitatív valós idejű PCR-rel értékeltük SYBR green és egy ABI 7900HT szekvencia detektáló rendszer (Applied Biosystems) alkalmazásával. Az alapozókat az 1. táblázat tartalmazza.
Western blot, immunfestés és szövettan
Teljes sejtprotein-kivonatokat állítottunk elő
Röntgen képalkotás
A bemutatott kép tizennégy hetes hím Slc3a1 -/- egerek. A kőképződés időbeli figyelemmel kísérése céljából az egereket a Vanderbilt Egyetem Képzőtudományi Intézetébe vitték, izoflouránnal és oxigénnel mozgásképtelenül altattak, majd egy Faxitron 2000 röntgengépbe helyezték a 35-ös beállítást 4 másodperces expozíciós időre.
Biomarker és aminosav mérések
A BUN és a kreatinin méréséhez a vért egy alvadék aktivátorral ellátott mikrovette CB 300 Z csőbe vettük (Sarstedt, Newton, NC), izoflurán érzéstelenítés alatt, 5,5 mm-es lancettel submandibularis vérzéssel. A mintákat szobahőmérsékleten> 30 percig alvadtuk, és 10 000 percig 4500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A szérumot azonnal aliquotizáltuk és 80 ° C-on tároltuk a vér karbamid-nitrogénjének mérésére a Vanderbilt Egyetem Orvosi Központ összehasonlító patológiai laboratóriumával és kreatinin-méréssel az Alabama Egyetem-Birmingham O'Brien Központ Core C Biomarkerek Laboratóriumával az LC-MS/KISASSZONY. A plazma aminosavkoncentrációkat reverz fázisú HPLC-vel határoztuk meg Bidlingmeyer és mtsai. [23].
Glutation mérések
A glutation szintjét GSH-GLO Glutation Assay (Promega, Madison, WI) alkalmazásával mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A májlizátumok fehérjekoncentrációját BCA-val határoztuk meg, és a koncentrációkat 400 ng/μl-re normalizáltuk. A májlizátumokat +/− 500 μM TCEP-vel vizsgáltuk. A TCEP csökkenti a mintában található oxidált glutationt. A lumineszcenciát FLUOStar-Omega mikrolemez-olvasóval mértük.
Eredmények
Először megerősítettük a Slc3a1 RT-PCR alkalmazásával az expressziós szintek értékelésére a különböző szövetekben. Ahogy az várható volt, Slc3a1 Az RNS szintje drámai módon csökkent azokban a szövetekben, ahol az expresszió normálisan előfordul, mint például a vese és a vékonybél (1a. Ábra). Ezenkívül a várakozásoknak megfelelően, Slc7a9 Az RNS szintje nem változott a Slc3a1 (1b. Ábra). Ezután Western blot és immunfluoreszcens mikroszkópiát alkalmaztunk az rBAT expresszió elvesztésének értékelésére a Slc3a1 -/- egerek. A Western blot kimutatta az rBAT expresszió elvesztését a vese lizátumaiból (1c. Ábra). Az rBAT immunfluoreszcens mikroszkópiája kimutatta, hogy az Slc3a1 az rBAT expresszió elvesztését eredményezte a proximális tubulusokban Slc3a1 -/- egerek összehasonlítva a vad típusú egerekkel (1d. és e. ábra).
Slc3a1 a transzkriptumok és az rBAT fehérje expressziója elvész a férfiban Slc3a1 kieső egerek. Slc3a1 -/- az egerekben a Slc3a1 RNS (a), hanem a Slc7a9 RNS () a vesében és a vékonybélben. A hólyag és a máj negatív kontrollként szolgál. Három példányban elvégzett két független kísérlet átlaga látható (átlag ± SD). (c) Az rBAT reprezentatív Western blotja vad típusú és Slc3a1 -/- egerek. Immunfluoreszcenciát alkalmaztunk vad típusú rBAT expresszió értékeléséhez (d) és férfi Slc3a1 -/- egerek (e). A knockout állatok kimutatták az rBAT expresszió elvesztését a proximális tubulusban
A knockout egereknél nem alakultak ki vesekövek, de röntgensugárral kimutatható hólyagkövek voltak, amint arról korábban beszámoltunk (2a. Ábra) [10]. A korábbi megfigyelésekkel összhangban megfigyeltük a nemek közötti különbségeket a férfi és a nő között Slc3a1 -/- nőstény egereknél nagyon ritkán alakulnak ki hólyagkövek [10]. Nem figyeltünk meg nagy mennyiségű hólyagkőképződést férfiakban Slc3a1 -/- egerek normál chow-n (0,31% cisztin) (2. táblázat). Amikor azonban a hímet elhelyeztük Slc3a1 -/- egerek tenyészállaton (0,36% cisztin), a hólyagkő képződésének nagyobb arányát figyeltük meg. Összehasonlítva a hólyagköves egerek százalékos arányát a 28. héten, az Slc3a1 A tenyésztő chow-ban lévő egereknek hólyagkövei voltak, míg az egereknek csak 42% -a volt Slc3a1 - A rendes chow-on lévő egerek hólyagkőképződést mutattak (2b. ábra). A húgyhólyagkő képződésének sebességét az egereken a tenyésztő chow-n az ábra mutatja. 2c. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az étrendi bevitel nagy hatással lehet a kőképződés mértékére Slc3a1 -/- egerek.
Férfi Slc3a1 -/- az egereknél a húgyhólyagkő képződésének sebessége az étrendtől függően eltérő. a Tipikus hólyagkőképződésű egerek röntgensugarai. A normál chow egerek 42% -ánál húgyhólyagkövek voltak 28. hétig, míg az egerek 100% -ánál húgyhólyagkövek voltak 28. héten a tenyésztő chow-nál ( = 12). c Röntgen Slc3a1 -/- az állatok a tenyészállaton felfedték a húgyhólyag kőképződését, amelyet egy Kaplan-Meier-féle cselekmény ábrázol ( = 8)
Megfigyeltük azt a hímet Slc3a1 - - - az egerek súlya folyamatosan alacsonyabb volt, mint az Slc3a1 +/ + azonos korú egerek (3a., b. ábra). A nőstény egereknél ezt a súlykülönbséget nem összegezték. Valamennyi egér orrától a farkának típusáig azonos hosszúságú volt, jelezve, hogy a teljes anyagcsere-fenotípus, nem pedig a táplálkozási hiány, hozzájárult a tenyészállaton tenyésztett és tartott kis egerek súlykülönbségéhez (3c. Ábra). Értékeltük a plazma aminosavszintjét Slc3a1 -/- egerek és összehasonlítottuk őket vad típusú egerekkel (3. táblázat). Összhangban a csökkent férfi testtömeggel Slc3a1 -/- egereknél egy súlyosabb fenotípust figyeltünk meg, aminek több aminosav-szintje különbözött a vad típusú és a knockout állatok között. Az aminosavak értékelése férfi és nő esetében egyaránt Slc3a1 Az egerekből csak az ornitin, a lizin és a taurin mutatkozott, amelyek mindkét nemben csökkentek. Ezért az rBAT kiiktatása ezekben az állatokban csökkent plazma ornitint és lizint eredményezett. A cisztein, amely két molekula összekapcsolásakor képezi a cisztint, taurinná metabolizálódik [24], amely szintén csökkent a nemek között. Érdekes módon a plazma cisztin csak férfiaknál csökkent Slc3a1 -/- annak ellenére, hogy mind hím, mind nőstény egereknél cystinuria mutatkozik [11].
A vad típusú és hím szövettani elemzése Slc3a1 -/- vese és hólyag 10–12 hónapos korban. Emelkedett kreatininszintű egerek vese ( és d) több tubuláris dilatációt és fibrózist mutatnak, összehasonlítva a normál kreatinintartalmú egerekkel (a és c) rendszeresen (a és ) vagy tenyésztő chow (c és d). Vad típusú hólyagok (e), kiütés normál kreatininnel (f), és kiütés emelkedett kreatininszinttel (g) egerek is láthatóak. A kiütések gyulladásos infiltrátumot és cisztin kristályokat mutatnak be. Panel (g) bemutatja a hólyag falába ágyazott cisztin kristályokat (nyilak). Az egerek minden egyes csoportjának reprezentatív H&E foltjai láthatók
A férfi glutationszintje Slc3a1 -/- egerek 8 hetes korban. Csökkentett (GSH) és oxidált (GSSG) glutationszinteket mértünk a vad típusú és Slc3a1 -/- állatok. A GSH, a GSSG, az összes és a redukált és oxidált formák aránya (GSH: GSSG) mind csökkent Slc3a1 -/- egerek ( = 6 ± SEM)
Vita
A cystinuria kezelése az elmúlt 20 évben drámai módon nem változott annak ellenére, hogy jobban megértették a genetikai alapokat [1]. A cystinuria egérmodelljei nemcsak megerősítik a betegség genetikai alapját, hanem modelleket is kínálnak az új terápiák tesztelésére és értékelésére [10]. Valószínűleg vannak olyan gének, amelyek befolyásolják a kőképződést a cystinuriában szenvedő betegeknél, amelyek a betegek elemzéséből származhatnak, majd egérmodellekkel tesztelhetők. Valószínűleg vannak olyan gének, amelyek befolyásolják a kőképződést a cystinuriában szenvedő betegeknél, amelyek a betegek elemzéséből származhatnak, majd egérmodellekkel tesztelhetők. Nemrégiben Zee és mtsai. kimutatta, hogy az α-liponsav megakadályozza a cisztin kő képződését a cikkben közölt egérmodellben [11].
Három A típusú cystinuria egérmodellt állítottak elő, beleértve az itt leírtakat, amelyet az exon 1 deléciója generált [10]. A többi modell spontán mutációból (E383K) [9] vagy ENU által indukált mutagenezisből (D140G) áll [8]. A D140G modell 129S2/SvPasCrl háttéren 40% -kal csökkentette a túlélést 15 hétre a szérum BUN emelkedésével, bár a szérum kreatininszintje vagy az interstitialis vesefibrózis nem nőtt [9]. Ezekben a megfigyelésekben a nemek közötti lehetséges különbségeket nem kommentálták, bár a kövek főleg férfiaknál fordultak elő [9]. Az E383K modell a C3HeB/FeJ hátterében 20 hetes hím egerekben megemelkedett szérum BUN-t és 32–48 hetes hím egerekben csökkent vese súlyt mutatott, egyik nőstény fenotípust sem figyeltek meg nőstény egerekben [8]. A férfiak és a nők között a cystinuria összefüggésében megfigyelt nemek közötti kőképződés különbségét a betegeknél megfigyelték, és másutt áttekintették [27, 28]. Úgy tűnik, hogy a kőképződés különbsége nem a vizelet cisztinszintjének különbségei, hanem a férfi és a női vizelet közötti differenciális cisztin aggregáció következménye [27, 29]. Ennek ellenére tanulmányunk kimutatta, hogy a CKD idős férfiakban fordul elő Slc3a1 -/- egerek.
Kevéssé ismert arról, hogy milyen tényezők befolyásolják a cystinuria fenotípusát és a CKD-re való progressziót. [2] Megállapítottuk, hogy a diéta táplálta a Slc3a1 -/- az egerek drámai hatással voltak a kőképződés sebességére. A cystinuria gyakori kezelése magában foglalja az étrend nátrium- és fehérjebevitelének korlátozását, a megnövekedett folyadékbevitelt, a vizelet lúgosítását, esetleg még a tiol gyógyszereket és a kaptoprilt is [1]. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az alacsony fehérjetartalmú étrend, több növényi fehérjeforrással, csökkentette a cystin kiválasztását a cystinuria-betegeknél [30]. Nem találtunk tanulmányt a diéta szerepéről a cisztin kő képződésében a cystinuria egérmodelljeiben. Hiányoznak humán klinikai vizsgálatok az étrend hatásáról az emberi cystinuria lehetséges módosítására [2]. A jövőbeni tanulmányok irányíthatók az étrendi változások kontrolláltabb értékelésére, hogy kiküszöböljék azokat a módosításokat, amelyek lassíthatják a kőképződés progresszióját cystinuriában.
A cisztin vizeletből történő visszanyerésének képtelensége valószínűleg megváltoztatja a cisztin anyagcseréjét az egész állatban. Kiesése Slc3a1 nemcsak a vesében, hanem a belekben is befolyásolja kifejeződését. A bél peptid transzporter Pept1 (Slc15a1) úgy gondolják, hogy lehetővé teszi a cisztin és más aminosavak újbóli felszívódását a bélből, némileg kompenzálva a veszteséget Slc3a1 a belekben [31, 32]. Jelenleg nem ismert, hogy ez hogyan járulhat hozzá a cystinuria általános nemi különbségéhez és a plazma aminosavszintekben megfigyelt különbségeinkhez.
Következtetések
Bebizonyítottuk, hogy az étrendi bevitel hatással lehet a cystinuria fenotípusának súlyosságára, mind a kőképződés, mind a CKD kialakulása szempontjából a cisztinuria egérmodelljében. A hím egerek súlyosabb fenotípust mutattak ki az állatok tömegére és a plazma aminosav-összetételére vonatkozóan. A cystinuria befolyásolta a máj glutation-összetételét. A jövőbeni vizsgálatok szisztematikusan értékelik az étrendi összetevőket a cystinuria fenotípuson és azt, hogy a glutation metabolizmusának ebből adódó változása milyen hatással van a fiziológiára és a patofiziológiára.
Az adatok és anyagok rendelkezésre állása
A jelenlegi vizsgálat során felhasznált és/vagy elemzett adatkészletek ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől beszerezhetők.