A hasi fájdalom érzését a peritonealis carcinomatosis váltja ki a

Masami Suzuki, Minoru Narita, Minami Hasegawa, Sadayoshi Furuta, Tomoyuki Kawamata, Maho Ashikawa, Kanako Miyano, Kazuyoshi Yanagihara, Fumiko Chiwaki, Takahiro Ochiya, Tsutomu Suzuki, Motohiro Matoba, Hiroki Sasaki; A peritoneális carcinomatosis által kiváltott hasi fájdalom érzését a P anyag és μ-opioid receptorok expressziójának változása kíséri az egerek gerincvelőjében. Aneszteziológia 2012; 117: 847–856 doi: https://doi.org/10.1097/ALN.0b013e31826a4ac8

Hivatkozási fájl letöltése:

A peritoneális carcinomatosisban szenvedő betegek gyakran hasi fájdalmakról számolnak be, amelyek viszonylag refrakterek a morfinra. Úgy ítélték meg, hogy új típusú állatmodellre van szükség a hasi fájdalom mechanizmusának vizsgálatához az ilyen típusú fájdalom optimális kezelésének kidolgozásához.

A peritonealis carcinomatosis modell elkészítéséhez a hasüregbe erősen peritonealis magvú gyomorrák sejteket (60As6) ültettek be. A fájdalommal kapcsolatos viselkedés nociceptív modalitását a mechanikus ingerekre és a görnyedt viselkedésre adott válaszként alkalmazott megvonási viselkedés szempontjából értékelték. Az egér hátsó gyökér ganglionjaiból és a gerincvelőből származó szövetmintákat immunhisztokémiai és valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakciónak vetettük alá.

A peritoneális disszeminációval rendelkező egerek jelentős túlérzékenységet mutattak a hasban a mechanikus stimulációval és a spontán visceralis fájdalommal kapcsolatos viselkedéssel szemben. A daganatot hordozó egerekben a gerincvelőben jelentősen megnőtt a c-Fos-pozitív sejtek száma. Ezek az egerek figyelemre méltóan növelték az anyag P-pozitív idegsejtjeit a háti gyökér ganglionjaiban (kontroll vs. tumor, 15,4 ± 1,1 vs. 24,2 ± 3,6, P

A P anyag fel- és a hátsó gyökér ganglionokban észlelt μ-opioid receptor csökkentett szabályozása - legalábbis részben - felelős lehet a peritonealis carcinomatosishoz társuló hasi fájdalom-szerű állapotért.

Amit már tudunk erről a témáról

Egyes rákos betegeknél a tumor a hasi hashártyában terjed

A széles körben elterjedt peritonealis daganatok, a carcinomatosis fájdalmas és refrakter lehet a hagyományos fájdalomcsillapító terápiákkal szemben.

Amit ez a cikk mond nekünk, az új

A nyomozók kidolgozták a carcinomatosis egérmodelljét

A viselkedési vizsgálatok azt mutatják, hogy a fájdalommal kapcsolatos válaszok jelen vannak, és a betegekhez hasonlóan a válaszok rezisztensek a morfinra

A jövőben kísérleti fájdalomterápiák tanulmányozhatók

A rákhoz kapcsolódó mérsékelt vagy súlyos fájdalom drámai módon ronthatja a betegek életminőségét és túlélését, és az áttétes vagy előrehaladott stádiumú rákban szenvedők 64% -át érinti.1. A fájdalom észlelt intenzitása a rák specifikus típusától és helyétől függ, valamint az egyes betegek fájdalomérzékenysége. 2 A rákkal kapcsolatos fájdalmat általában opioidokkal, nem szteroid gyulladáscsökkentőkkel, kortikoszteroidokkal, helyi érzéstelenítőkkel, antidepresszánsokkal és görcsoldókkal kezelik, akár önmagukban, akár kombinációban. egyes terminális rákos betegeknél nehéz lehet kezelni a fájdalmat. Ennek megfelelően hatékonyabb kezelésekre van szükség. A rákos megbetegedésekkel kapcsolatos fájdalom mechanizmusának rossz ismerete továbbra is fő akadályt jelent az új fájdalomcsillapítók felfedezésében, hogy megfeleljenek ennek az igénynek.

Anyagok és metódusok

Valamennyi kísérletet a Nemzetközi Fájdalomkutatási Szövetség etikai irányelveinek15 megfelelően hajtották végre, és a Nemzeti Rákközpont (Tsukiji, Tokió, Japán) Állatkísérleti Etikai Bizottsága jóváhagyta. A kísérletek során igyekeztek minimalizálni a felhasznált állatok számát és szenvedéseiket.

Állatok

A hím C.B17/Icr-scid egereket és a Rákkutató Intézet 22–25 g tömegű egereit használtuk. Az egereket a CLEA Japan-tól (Tokió, Japán) vásároltuk, és 23 ± 1 ° C-os szobahőmérsékleten tartottuk, 12 órás világos-sötét ciklus alatt. Az egereket meghatározott kórokozótól mentes körülmények között tartottuk, és steril táplálékot, vizet és ketreceket biztosítottak hozzájuk.

Sejtvonalak és kultúra

Humán scirrhous gyomorrák sejtvonalat, a HSC60-ot hoztuk létre a korábbiakban leírtak szerint. 16 A magas peritonealis vetőmagú sejtvonalat, a 60As6-ot HSC60-ból állítottuk össze ortotópos szövet beültetésével scid egerekbe. 17 Röviden: a HSC60 sejtek xenograft tumorját átültették a gyomorba egy mocskos egér fala. Hat iteráció után ascitikus daganatsejteket gyűjtöttünk, és ezeknek a sejteknek az ortotópos beoltását egerekbe végeztük, hogy létrehozzunk egy nagyon metasztatikus 60As6 sejtvonalat. Ezt a sejtvonalat magzati borjúszérummal (10%), 100 U/ml penicillin G-nátriummal és 100 μg/ml sztreptomicin-szulfáttal kiegészített RPMI1640 táptalajban tartottuk 5% szén-dioxid és 95% levegő atmoszférában 37 ° C-on. A luciferáz gént expresszáló transzfektánsok létrehozásához a szentjánosbogár luciferáz gént hordozó plazmid vektorokat, amelyeket pLuc/Neo-nak neveztek, és egy transzfekciós reagenst, a LipofectAMINE 2000-t (Invitrogen, Carlsbad, CA) használtak a gyártó ajánlása szerint. Geneticint (500 μg/ml; Invitrogen) használtunk a stabil transzfektánsok szelektálására, és a transzfektált klónokat luciferáz gén expresszió szempontjából átvilágítottuk a biolumineszcencia detektálásával IVIS rendszerrel (Xenogen, Alameda, CA). A luciferáz gént expresszáló klónokra 60As6Luc sejteket neveztek.

60As6Luc sejtek intraperitoneális beoltása

A 60As6Luc sejtek sűrűségét 1 × 106 sejtre állítottuk 1 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). A kísérleti csoportban a sejtszuszpenziót a hasüregbe injektálták, a középső hasba behelyezett 26,5-es tűn keresztül. A kontroll csoportban PBS-t injektáltunk a hasüregbe 60As6Luc sejtek helyett.

A daganat növekedésének mérése Luciferase Imaging segítségével

A daganat növekedésének mérésére IVIS képalkotó rendszerrel végzett teljes test luciferáz képalkotást alkalmaztunk a 60As6Luc sejtek 10 perces integrációs idő alatt történő megjelenítésére a kép megszerzéséhez, a korábban leírtak szerint. 18 Röviden: az egereket intraperitoneálisan injektáltuk 15 mg D-luciferinnel. káliumsó 1 ml PBS-ben, 26,5-es fecskendővel. Ezután izofluránnal altattuk őket. A relatív tumoráttét-terhelést az Living Image szoftver segítségével határoztuk meg (2.50 verzió, Xenogen).

Akut hasnyálmirigy-gyulladás modell

A Caerulein a kolecisztokinin analógja, amely akut hasnyálmirigy-gyulladáshoz vezet. Az akut hasnyálmirigy-gyulladást egerek többszöri caerulein-injektálásával indukálták (intraperitoneális beadás; 50 μg/kg; hatszor, 1 órás időközönként). 19.20 Caeruleint (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) fiziológiás sóoldatban oldottunk fel.

Gyulladásos fájdalom modell

Az izofluránnal altatott egereknél a jobb hátsó mancs plantáris felszínét 20 μl-es térfogatban Freund teljes adjuvánsával (CFA; Mycobacterium tuberculosis; Sigma Chemical Co.) injektáltuk, hogy kialakuljon a tartós gyulladásos fájdalom modellje.

Viselkedési teszt

A has mechanikus stimulációval szembeni túlérzékenységét úgy számszerűsítettük, hogy megszámoltuk az elvonási magatartások számát (a has kivonása a von Frey-szál elől, a has nyalása stimuláció következtében vagy az egész test elvonása) válaszként mechanikus stimuláció (von Frey-szálak 0,02 g hajlítóerővel) a hasra. 19,20 egeret egy megnövelt dróthálós padlóra helyeznek, és az egyes felborult fekete műanyag dobozok alá zárják. A von Frey-szálakat a háló padlóján keresztül a has felszínének különböző pontjaira vittük fel. Mindegyik szálat ötször alkalmaztuk 5–10 másodperces időközönként, majd ismét egyperces pihenőidő után, összesen 10 alkalommal. A nociceptív viselkedést az alábbiak szerint értékeltük: 0 = nincs válasz; 1 = azonnali menekülési kísérlet, a könnyű ingerlés vagy a stimulált hely megkarcolása; 2 = a has intenzív elvonása vagy ugrás. A jelentett értékek a 10 kihívásra adott válaszok összesített pontszámai. A megfigyelő nem tudott az egér kísérleti állapotáról. Viselkedéstesztet a tumor beoltását követő 14. és 28. napon végeztünk.

A görnyedés viselkedését a korábbiakban leírtak szerint némi módosítással megvizsgáltuk.14 Röviden: az egereket egyenként helyeztük el egy nyílt terepen lévő aréna közepén, és 180 másodpercig figyeltük őket. A görnyedés pontszáma az összes idő (ek), amikor az egér görnyedt viselkedését megszorozta a pontozási faktorral, amelyet Sevcik és mtsai. 14: 0 = normál kabátfény, feltáró magatartást mutat; 1 = enyhe, lekerekített hátú testtartás, kissé csökkent felfedező magatartás, normális kabátfény; 2 = súlyos, lekerekített háttartás, jelentősen csökkent felfedező magatartás, piloerekció, időszakos hasi összehúzódások. Viselkedéstesztet a tumor beoltását követő 14. és 28. napon végeztünk. A megfigyelő nem tudott az egér kísérleti állapotáról. Viselkedéstesztet a tumor beoltását követő 14. és 28. napon végeztünk.

Immunhisztokémia

Valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR)

1. táblázat: A kísérletben jellemzett egérgének példa szekvenciái

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag ± szórásként (SD) adunk meg. A kísérletek során felhasznált összes statisztikai paramétert a GraphPad PRISM (5.0a verzió; GraphPad Software, La Jolla, CA) alkalmazásával számoltuk ki. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját egyirányú ANOVA-val értékeltük, amelyet Bonferroni többszörös összehasonlító teszt vagy párosítatlan Student t-teszt (kétfarkú) követett. 6 sejt/üreg P értéke. A fotonszámláló elemzéseket a disszemináció helyén végeztük 7 napos időközönként. Az 1A. Ábra egy tipikus példát mutat be. Ez a módszer lehetővé tette ugyanazok az állatok megfigyelését az idő múlásával. A peritonealis disszemináció progresszióját tükröző tumor növekedési görbét a fotonok számának az idő függvényében történő ábrázolásával kaptuk (1B ábra, n = 5). Az egerekben a peritonealis disszemináció makroszkopikus megjelenése alapján 28 nappal az oltás után megemlítettük a mesenteriumban és a parietális hashártyában való elterjedést (1. ábra, C és D ábra, nyílhegyek).

ÁBRA. 1. A peritoneális metasztázis modell jellemzése. A peritoneális disszemináció fotonszámláló elemzése a 60As6 Luc sejtek intraperitoneális beoltása után. A hasüregben 60As6Luc daganatot hordozó Scid egereket altattuk és megfigyeléseknek vetettük alá őket a luciferin (A) intraperitoneális beadása után. A tumorsejtek peritonealis disszeminált metasztázisának progressziójának kvantitatív elemzése (n = 5). Ezt a kísérletet háromszor megismételtük, és minden alkalommal hasonló eredményeket figyeltünk meg (B). A peritonealis disszemináció makroszkópos bizonyítékai tumorsejteket hordozó scid egerekben. A bélben (C, nyílhegyek) és a parietális peritoneumban (D, nyílhegyek) áttétes elváltozások voltak. Mérleg: 10 mm.

Túlérzékenység a peritonealis carcinomatosis okozta mechanikus stimulációval és visceralis fájdalommal kapcsolatos viselkedéssel szemben

A peritoneális carcinomatosis által kiváltott c-Fos-pozitív sejtek változásai a gerincvelő hátsó szarvában

A P anyag, a CGRP és a MOR expressziójának változásai, amelyeket peritonealis carcinomatosis váltott ki egerekben

Az egerek peritoneális carcinomatosis által kiváltott P-pozitív DRG neuronok MOR-változásai

A morfin szisztémás beadásának hatása a nociceptív viselkedésre a tumoros egerekben, a Caerulein-injekcióban és CFA-val injektált egerek mechanikai stimulációjára adott válaszban

Vita

Az előrehaladott stádiumú rákos betegek, különösen a csontáttétes és a rákos peritonitisben szenvedők jelentős fájdalmat szenvednek el. A csontrombolással és idegkárosodással járó daganatokban szenvedő betegeknél különösen valószínű, hogy súlyos fájdalmat tapasztalnak. a fájdalmat gyakran magasabb morfin dózisokkal kezelik, ami mellékhatásokkal is járhat, beleértve a szedációt, a légzésdepressziót és a gyomor-bélrendszer mozgékonyságának zavarását, és gyakran csak hiányos enyhülést nyújt. Nem meglepő, hogy új, hatékonyabb fájdalomcsillapítókra van szükség súlyos opioidrezisztens rákfájdalmak, például a rákos peritonitis okozta hasi fájdalom kezelésére.

Ebben a tanulmányban újszerű egérmodellt dolgoztunk ki a rákos peritonitis okozta hasi fájdalmakra. Általában nehéz ellenőrizni a daganatok növekedését és az azt követő progressziót rákos peritonitisszé, ellentétben a szubkután daganatokkal. A jelenlegi tanulmányban a valós időben történő disszemináció progresszióját figyeltük meg luciferáz génnel transzfektált sejtek és in vivo fotonszámláló elemzés segítségével. Az emittált fotonintenzitás szintje a tumorsejt beoltása után fokozatosan növekedett az idő múlásával, és az intenzitás szintje a tumor beoltását követő 28. napon megközelítőleg tízszerese volt a 7 napos szintnek. A peritoneális disszeminációval rendelkező egerek mind a nociceptív pontszámuk drámai növekedést mutattak a mechanikus stimulációra és a viscerális fájdalommal kapcsolatos viselkedésre reagálva a tumorsejtek oltása után 28 nappal. Ezeket a fájdalomszerű viselkedéseket azonban az oltás után 14 nappal nem figyelték meg, ami arra utal, hogy ez a hasi túlérzékenység elsősorban egereknél figyelhető meg a rákos peritonitis viszonylag késői szakaszában.

A nociceptorok információt közvetítenek a perifériáról a gerincvelőig, ahol a hátsó szarvak felszínes (L1–2 laminae) és mély rétegeiben (L3–5 laminae) található másodlagos neuronokat célozzák meg. ezt a nociceptív információt a központi idegrendszerhez.31. A gerincvelői idegsejtek fájdalommal kapcsolatos változásainak vizuális azonosításához ebben a modellben megfigyeltük a c-Fos, azonnali-korai gén immunreaktivitásának változását, amelyet széles körben alkalmaznak a fájdalomban kutatás az idegsejtek aktivációjának markerként.32, -, 34 Az oltás után 28 nappal a c-Fos-pozitív sejtek növekedése volt megfigyelhető mind a gerincvelő felszíni, mind a mély rétegeiben. A gerincvelő másodrendű neuronjai, amelyek zsigeri afferens bemenetet kapnak, elsősorban a felszíni gerincrétegekben helyezkednek el, mélyebben az L5 és L10 lamellákban. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a szomatikus struktúrák afferenseket küldenek az L1–3, valamint a mély L4 és L5 lamellákhoz. széles körű fájdalom előrehaladását eredményezi, amelyet a gerincvelő c-Fos-pozitív sejtjeinek növekedése kísér.

Összegzésképpen elmondható, hogy a peritoneális carcinomatosisban szenvedő egerek túlérzékenyek a mechanikus stimulációval és a zsigeri fájdalomhoz hasonló viselkedéssel, amit a P anyag felfelé és a MOR lefelé szabályozásával jár. Ez az újonnan kifejlesztett modell fontos lehet a rákos peritonitis okozta hasi fájdalom patogenezisének tanulmányozásában.