Az inozin csökkenti a gyulladást és javítja a túlélést a colitis egérmodelljében

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; és

Sebészeti Klinika, Orvostudományi és Fogorvosi Egyetem - New Jersey Medical School, Newark, New Jersey 01703

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; és

Sebészeti Klinika, Orvostudományi és Fogorvosi Egyetem - New Jersey Medical School, Newark, New Jersey 01703

Inotek Pharmaceuticals, Beverly, Massachusetts 01915; és

Absztrakt

Az inozinról, az adenozin lebomlásából képződő, természetben előforduló purinról, nemrégiben kimutatták, hogy erőteljes gyulladáscsökkentő hatást fejt ki mind in vivo, mind in vitro. Ez a tanulmány az inozint a vastagbélgyulladás lehetséges terápiájaként értékelte. A vastagbélgyulladást dextrán-szulfát-nátrium (DSS) beadásával indukálták egerekben. Az inozinnal történő orális kezelést vagy a vastagbélgyulladás megjelenése előtt, vagy utókezelésként kezdték meg, miután a vastagbélgyulladás létrejött. A vastagbélkárosodás és gyulladás értékelését durván (testtömeg, végbélvérzés), szövettanilag és biokémiailag (az MPO, az MDA és a citokinek vastagbélszintje) határoztuk meg. A DSS által kiváltott vastagbélgyulladás szignifikánsan fokozta a gyulladásos sejtek behatolását a vastagbélbe. A DSS által kiváltott vastagbélgyulladás emelte a lipidperoxidáció, a citokinek és a kemokinek vastagbélszintjét is. Az inozin megvédte a vastagbelet a DSS-indukálta gyulladásos sejtek beszűrődésétől és a lipidperoxidációtól. Az inozin szintén részben csökkentette ezeket a paramétereket a megállapított vastagbélgyulladás kísérleti modelljében. Így az inozin-kezelés potenciális terápiát jelenthet a vastagbélgyulladásban.

A reagenseket a következő forrásokból nyertük: DSS (40 000 MW) az ICN Pharmaceuticals cégtől származik; az inozin, a humán MPO, az 1,1,3,3-tetrametoxi-propán, a tiobarbitursav, a nátrium-dodecil-szulfát, a tetrametil-benzidin, a hexadecil-trimetil-ammónium-bromid és a hidrogén-peroxid a Sigma (St. Louis, MO) cégtől származik; A BALB/c egerek a Taconic Farms-ból (Germantown, NY) származnak; és specifikus citokin ELISA készletek az R&D Systems-től (Minneapolis, MN).

A vastagbélgyulladás kiváltása és kezelése.

8 hetes hím BALB/c egereket használtak 20–23 g tömegűek ezekhez a vizsgálatokhoz. Az állatokat szabályozott hőmérsékletű és világos-sötét ciklusban 48 órán át szobákban tartják, mielőtt kísérleti protokollokat kezdenének. Valamennyi állatkísérletet az „Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és felhasználásához” [DHEW publikáció No. (NIH) 85–23, felülvizsgált 1985, Tudományos és Egészségügyi Jelentések Hivatala, DRR/NIH, Bethesda, MD 20205] és az Inotek Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottságának jóváhagyásával.

Az egereket 5% DSS-sel tápláltuk, 30–40 kDa molekulatömeggel desztillált vízben ad libitumban oldva a kísérlet során (31). Az inozint orálisan, szondával vagy intraperitoneálisan adták be naponta kétszer. A kontroll egereket vivőanyaggal kezeltük, amely vizet jelentett az orális inozin kísérleti protokollhoz vagy sóoldatot az intraperitoneális inozin kísérleti protokollhoz. A késleltetett inozinkezelési kísérletekhez az egereknek vivőanyagot adtak az inozinkezelés megkezdésének napjáig. Az inozint 25 és 200 mg · kg – 1 · nap –1 közötti dózisokban adták be, és a közelmúltban végzett vizsgálatokon alapult, amely inozint rágcsáló gyulladásos modelleken tesztelt (14, 18, 25). A DSS oldat bevitelét a kísérletek során figyelték, és megállapították, hogy a kísérleti csoportok között változatlan (az adatokat nem mutatják be).

A vastagbélgyulladás súlyosságának és gyógyszeres hatásainak értékelése.

A kísérletekben rögzített paraméterek a testtömeg, a vastagbél hossza, a mortalitás és a végbélből történő vérzés volt, amelyet szemellenőrzéssel határoztak meg. Az egereket lemértük 1. nap és 10.a későbbi vastagbélgyulladás okozta súlyváltozással az eredeti tömeg százalékában kifejezve. Az egereket méhnyak diszlokációval leöltük, és a vastagbelet reszektáltuk az ileocecalis csomópont és a proximális végbél között, közel a pelvisternum alatti járatához. A vastagbelet nem abszorbens felületre helyeztük, és vonalzóval mértük. A vastagbél biopsziákat vettük szövettani és biokémiai elemzés céljából. Az egyik biopsziát 15% -os formaldehidben rögzítettük, paraffinba ágyazva és metszettük (4 μm-es szeletek). Ezután a metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festették, majd a vizsgáló (vakon) megtekintette, és a gyulladás súlyosságát (0 = nincs, 1 = enyhe, 2 = közepes és 3 = súlyos) és kiterjedését (0 = nincs, 1 = nyálkahártya) értékelte., 2 = nyálkahártya és nyálkahártya, és 3 = transzmurális), valamint kriptakárosodás (0 = nincs, 1 = bazális 1/3, 2 = bazális 2/3, 3 = elveszett epithelium kripták vannak jelen, és 4 = kripták és felszíni hám elveszett), itt reprezentatív szakaszok jelennek meg.

MPO tevékenység.

A vastagbél-biopsziákat (50 mg/ml) 0,5% hexadecil-trimetil-ammónium-bromidban 10 mM MOPS-ban homogenizáltuk és 15 000-nél centrifugáltuk. g 40 percig. Ezután a szuszpenziót háromszor 30 másodpercig ultrahanggal kezeltük. A felülúszó alikvot részét (20 μl) összekevertük 1,6 mM tetrametilbenzidin és 1 mM hidrogén-peroxid oldatával. Az aktivitást spektrofotometriásan mértük, mint az abszorbancia változását 650 nm-en 37 ° C-on, Spectramax mikrolemez-olvasóval (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Az eredményeket MPO-aktivitás milligrammjaként fejezzük ki fehérje milligrammjára vonatkoztatva, amelyet Bradford-assay-vel határozunk meg.

Malondialdehid assay.

Malondialdehid képződést alkalmaztunk a vastagbél lipidperoxidációjának számszerűsítésére, és tiobarbitursav-reaktív anyagként mértük. A szöveteket 1,15% KCl pufferban homogenizáltuk (100 mg/ml). Ezután kétszáz mikroliter homogenizátumot adunk 1,5 ml 0,8% tiobarbitursavból, 200 μl 8,1% nátrium-dodecil-szulfátból, 1,5 ml 20% ecetsavból (pH 3,5) és 600 μl desztillált vízből álló reakcióelegyhez. Az elegyet ezután 45 percig 90 ° C-on melegítettük. Szobahőmérsékletre történő lehűlés után a mintákat centrifugálással tisztítottuk (10 000 ° C) g, 10 percig), és abszorbanciájukat 532 nm-en mértük, 1,1,3,3-tetrametoxi-propánt használva külső standardként. A lipidperoxidok szintjét MDA nanomol/milligramm fehérje értékben fejeztük ki (Bradford assay).

A vastagbél citokinszintje.

A harmadik vastagbélbiopsziát eltávolítottuk és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd a mintát 700 μl proteáz-inhibitorokat tartalmazó Tris-HCl pufferben homogenizáltuk. A mintákat 30 percig centrifugáltuk, és a felülúszót a vizsgálatig -80 ° C-on fagyasztottuk. A citokinszinteket ELISA alkalmazásával határoztuk meg.

Statisztikai analízis.

Az eredmények átlag ± SE; a statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, majd Student-Newman-Keuls többszöri összehasonlítással, post hoc analízissel, Fisher pontos tesztjével, Mann-Whitney-vel végeztük. U-teszt, vagy adott esetben Kaplan-Meier túlélési elemzés, a −1 · nap −1 inozin értéke intraperitoneálisan, ill. Hasonlóképpen, a rektális vérzés szignifikánsan, 60-ról 10-re és 0% -ra csökkent. Megvizsgáltuk az MPO és az MDA vastagbélszintjét is; mindkét esetben az inozin szignifikánsan csökkentette a szintet a vivőanyaggal kezelt állatokhoz képest. Az MPO-szintek 337 ± 60-ról 101 ± 21-re és 69 ± 16 mU/mg fehérjére csökkentek 100 vagy 200 mg · kg –1 · nap –1 inozin kezelés mellett. Hasonlóképpen, az MDA szintje 3,5 ± 0,5-ről 1,9 ± 0,3 nmol/mg fehérjére csökkent 200 mg/kg -1-1 nap -1 inozinnal. Az MDA szintje a vastagbélben 100 mg · kg -1 -1 nap -1 ip inozin után 2,5 ± 0,4 nmol/mg fehérje volt, amely statisztikailag nem különbözött szignifikánsan a hordozóval kezelt vastagbéltől.

1. táblázat: Az inozin dózisa függően csillapítja a kísérleti vastagbélgyulladás jellemzőit

Az adatokat átlag ± SE értékként fejezzük ki 10–20 állatból. A hím Balb/c egereket ad libitum hatásának tettük ki dextrán-szulfát-nátrium (DSS) oldatnak (5 tömeg%). Az inozint (25, 50, 100 vagy 200 mg · kg –1 · nap –1) orálisan adták naponta kétszer, kezdve 1. nap és tovább10. nap a kísérletet befejezték. A vastagbelet kivágtuk és megmértük. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, majd Student-Newman-Keuls többszöri összehasonlítással, post hoc analízissel vagy Fisher pontos teszttel végeztük, ahol * † ‡ F1-153

ÁBRA. 1.Az inozin dózisfüggően csökkenti az MPO szintjét (A) és a malondialdehid (MDA)) dextrán-szulfát-nátrium (DSS) által kiváltott akut vastagbélgyulladásban szenvedő egerek vastagbélében. Az egereket 10 napig ad libitumnak tettük ki DSS-ben, az inozinnal (25, 50, 100 vagy 200 mg · kg –1 · nap –1, naponta kétszer) kezeltük. nap l. Az eredményeket átlagosan ± SE-ként fejezzük ki 8–20 állatból, a statisztikai elemzést egyirányú ANOVA-val, majd Student-Newman-Keuls többszörös összehasonlítással végeztük el, post hoc elemzéssel, ahol

ÁBRA. 2.Az inozin (200 mg · kg –1 · nap –1) hatása a 10 napon át DSS-vel kezelt egerek vastagbélében megfigyelt morfológiai változásokra. Az inozint orálisan adták be kezdve1. nap. Ő 10. nap, egereket leöltünk, vastagbélbiopsziákat vettünk és 10% -os formalinos oldatban rögzítettük. A mintákat paraffinba ágyazottuk és metszettük (3 μm-es metszetek). A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük, és × 100 vagy × 400 nagyítással néztük meg őket. A bemutatott szakaszok 10 egér metszetét reprezentálják. Az első két oszlop nagyítása × 100, a harmadik oszlop × 400.

2. táblázat: A vastagbél metszeteinek szövettani elemzése, vivőanyag, DSS+ vivőanyagot és DSS + inozinnal kezelt egereket

A pontszámokat átlag ± SE értékként adjuk meg 10 állatból. A hím Balb/c egereket ad libitum módon DSS oldatnak tettük ki (5 tömeg%). Inozint (200 mg · kg –1 · nap –1) orálisan adtak be naponta kétszer, kezdve 1. nap. Ő10. nap, egereket feláldoztunk, vastagbélbiopsziákat vettünk és 10% -os formalinos oldatban rögzítettük. A mintákat paraffinba ágyazottuk és metszettük (3 μm-es metszetek). A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festettük és × 400-as nagyítással néztük meg, és vakon vettük a gyulladás súlyosságát (0 = nincs, 1 = enyhe, 2 = közepes és 3 = súlyos) és kiterjedését (0 = nincs, 1 = nyálkahártya, 2 = nyálkahártya és nyálkahártya, valamint 3 = transzmurális), valamint kriptakárosodás (0 = nincs, 1 = bazális 1/3, 2 = bazális 2/3, 3 = kripták elveszett hám van jelen, és 4 = kripták és felszíni hám elvesztek). A statisztikai elemzést a Mann-Whitney alkalmazásával végeztük U-teszt, ahol

* = kétfarkú értéke 0,0524,

† = kétfarkú értéke 0,0068, és

‡ = kétfarkú értéke 0,036 vs. a DSS + vivőanyag-kezelési csoport.

Az inozin részben csillapítja a betegség tüneteit a kialakult vastagbélgyulladásban. Kezdve 200 mg · kg –1 · nap –1 inozinnal kezelt egerek 4. nap vagy 7 a DSS megkezdése után megnőtt a vastagbél hossza, de nem volt hatással sem a vastagbélgyulladás által közvetített testsúlycsökkenésre, sem a végbélvérzés gyakoriságára (3. táblázat). Az egerek kezelése 4. nap inozin mellett alacsonyabb volt a vastagbélszint mind az MPO-ban, mind az MDA-ban (3. táblázat). Hosszú távú túlélési kísérletekben az 5% DSS-szel 30 napig kezelt egerek 100% -os halálozási arányt mutattak 20 napra (3. ábra). Ezzel szemben az inozinnal kezelt egerek (200 mg · kg –1 · nap –1) kezdetétől 1. nap, 4, vagy 7 a túlélés jelentős növekedését mutatta a 100, 70, illetve 30% -kal élő egereken 20. nap, és még tovább is 30. nap, Az egerek 60, 20 és 10% -a még életben volt (3. ábra).

3. táblázat: Az inozin gyengíti a betegség jellegzetességeit a bevált kísérleti vastagbélgyulladásban

Az adatok 10–12 állat átlagai ± SE. Inozint (200 mg · kg –1 · nap –1) orálisan adtak be naponta kétszer, kezdve 1., 4. nap, vagy 7 a DSS kezelés megkezdését követően. Ő10. nap, a kísérletet befejeztük, és az állatokat feláldoztuk. A vastagbelet kivágtuk és megmértük. Biopsziákat vettünk a myeloperoxidase (MPO) és a malondialdehid (MDA) vastagbélszintjének meghatározására. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA alkalmazásával, majd Student-Newman-Keuls többszöri összehasonlítással, post hoc analízissel vagy Fisher pontos teszttel végeztük, ahol

ÁBRA. 3.Az inozinkezelés jelentősen javítja az akut vastagbélgyulladással küzdő egerek túlélését. Az egereket 30 napig ad libitumnak tettük ki DSS-ben, az inozin-kezelést (200 mg · kg -1 -1 nap –1 naponta kétszer) megkezdték. napok l, 4, és7. Feljegyeztük a minden nap túlélő egerek számát. Az eredményeket 20 állat túlélési százalékában fejezzük ki. A statisztikai elemzést Kaplan-Meier túlélési elemzéssel végeztük, ahol

Az inozin hatása a vastagbél citokin profiljára.

A DSS-sel kezelt egereknél a gyulladásos kemokinek és a citokinek vastagbélszintje jelentősen megemelkedett (4. ábra, A és). A kezeletlen egereknél a kemokinek vagy citokinek vastagbélszintje nem volt kimutatható (az adatokat nem közöljük). Az inozin (200 mg · kg –1 · nap –1) jelentősen csökkentette a kemokinek vastagbélszintjét (4. ábraA) fő intrinsic protein (MIP) -1 és -2 és proinflammatorikus citokinek (4. ábra) IL-1, IL-6 és IL-12. Az inozin képes volt csillapítani a TNF vastagbélszintjét is (4. ábra).

ÁBRA. 4.Az inozin hatása a vastagbél kemokinére (A) és citokin () vastagbélgyulladás után. A citokinszinteket vastagbél-biopsziákban határoztuk meg egerektől, akiket 10 napon át kezeltünk DSS ± inozinnal (200 mg · kg –1 · nap –1). Az eredményeket átlagosan ± SE-ben fejezzük ki 10 állatból. A statisztikai elemzést egyirányú ANOVA-val, majd Student-Newman-Keuls többszörös összehasonlítással végeztük el, post hoc elemzéssel, ahol

Az inozinról kimutatták, hogy gátolja a poli (ADP-ribóz) szintetáz (PARS) enzimet, bár nagy koncentrációban (41). A PARS gátlása számos gyulladásos betegségben (37) hasznosnak bizonyult, ideértve az egér (44) és a patkány (29) kísérleti vastagbélgyulladását. Az inozin fokozhatja az endogén antioxidáns rendszereket is, mivel az inozin lebomlása révén az urát, az oxiradikumok és a peroxinitrit megkötője keletkezik (1, 4, 20, 39), mindkettő szerepet játszik a vastagbélgyulladás patogenezisében (36, 43). Megvizsgáltuk egy adott peroxinitrit bontási katalizátor hatékonyságát vastagbélgyulladásban is, és azt találtuk, hogy védő (23). A peroxinitrit-tisztító hatásai azonban a kolitikus egerek vastagbélében az immunsejt-infiltrációra és a citokin/kemokin szintre minimálisak voltak, és nem hasonlíthatók össze az inozin-kezeléssel megfigyeltekkel, az inozin-hatás szisztémás gyulladáscsökkentő mechanizmusának további bizonyítékai vastagbélgyulladás.

Az inozin mind a citokin felszabadulásra, mind a PARS gátlására, mind az uráttermelésre gyakorolt poszttranszkripciós jellege előnyösnek tekinthető, mivel a terápiás lehetőségek megnövekedett ablakára lehet számítani, vagyis az inozin a kezelés utáni paradigmában hatékony maradhat. Adataink arra utalnak, hogy az inozin képes csillapítani a kialakult vastagbélgyulladást. A purinokról kimutatták, hogy elősegítik a vékonybél fekélyek gyógyulását kísérleti enterocolitisben (40), és ez is szerepet játszhat az inozin kezelés utáni védőhatásaiban a vastagbélgyulladásban. A sérült nyálkahártya inozin általi javításának elősegítése magyarázhatja a vastagbélbe beszivárgó gyulladásos sejtek csökkenését.

Összefoglalva, bebizonyítottuk az inozin mint védő terápia hatékonyságát az egér vastagbélgyulladásának kísérleti modelljében. Az inozin nemcsak a vastagbélgyulladás kialakulásának megakadályozására volt képes, hanem jótékony hatással volt a kialakult betegségre is. A jelenlegi adatok, az inozin kiváló biztonságossági adatai mellett, azt sugallják, hogy az inozin mint colitis terápia tesztelésének és fejlesztésének koncepciója emberben igazolható lehet.

Ezt a tanulmányt az R43-DK-57379 (A. L. Salzmannak) és az RO1-GM-66189-01 (G. Hasko-nak) Nemzeti Egészségügyi Intézetek támogatták.

LÁBJEGYZETEK

Dr. J. G. Mabley, P. Pacher és A. Marton az Inotek Pharmaceuticals alkalmazottai; Dr. Szabó C. és A. L. Salzman az Inotek Pharmaceuticals alkalmazottai, tulajdonosai és részvényesei.

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezések címe: J. G. Mabley, Inotek Pharmaceuticals, Suite 419E, 100 Cummings Center, Beverly, MA 01915 (e-mail: [email protected] com).