Frontiers B12-vitamin hiány megváltoztatja a bél mikrobiotáját a vastagbélgyulladás táplálékának egérmodelljében

Táplálkozás és mikrobák

Szerkesztette
Silvia Turroni

Bolognai Egyetem, Olaszország

Felülvizsgálta
Ravinder Nagpal

Wake Forest Orvostudományi Kar, Egyesült Államok

Nobuhiko Kamada

Michigan Medicine, University of Michigan, Amerikai Egyesült Államok

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

megváltoztatja

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Sejtbiológiai program, Kutatóintézet, Beteg Gyermekek Kórháza, Toronto, ON, Kanada
  • 2 Gasztroenterológiai, hepatológiai és táplálkozási osztály, Gyermekgyógyászati ​​Osztály, Toronto, ON, Kanada
  • 3 Laboratóriumi Orvosi és Pathobiológiai Tanszék, Toronto Egyetem, Toronto, ON, Kanada
  • 4 Fiziológia és kísérleti orvoslás, Kutatóintézet, Beteg Gyermekek Kórháza, Toronto, ON, Kanada
  • 5 Orvostudományi Tanszék, Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, ON, Kanada
  • 6 Általános és mellkasi sebészeti osztály, Beteg Gyermekek Kórháza, Toronto, ON, Kanada
  • 7 Farncombe Family Digestive Health Institute, McMaster University, Hamilton, ON, Kanada

Célja: A gyulladásos bélbetegség (IBD) az autoimmun betegségek spektrumára utal, amely krónikus bélgyulladást eredményez. Korábbi eredmények azt sugallják, hogy az étrend, a táplálkozás és a bél mikrobiota diszbiózisa szerepet játszik mind az állapot kialakulásában, mind az állapot előrehaladásában. A B12-vitamin a metionin-szintáz kulcsfaktora, és kizárólag mikrobák termelik. Korábbi munkák a metionin-szintáz (MetH) szubsztrátjának, a homociszteinnek a megnövekedett szintjét kötik az IBD-vel, jelezve a B12-vitamin hiányának lehetséges szerepét a bélsérülésekben és gyulladásokban. Ez a tanulmány a B12-vitamin szerepét értékelte a bél mikrobiota alakításában és a bélsérülésekre adott válaszok meghatározásában, reprodukálható egér colitis-modell alkalmazásával.

Mód: Értékelték a B12-vitamin pótlásának és hiányának hatásait in vivo; A 3 hetes elválasztás utáni C57Bl/6 egereket három étrendi kezelési csoportba osztották: (1) elegendő B12-vitamin (50 mg/kg), (2) B12-vitamin-hiány (0 mg/kg) és (3) kiegészítve B12-vitamin (200 mg/kg) 4 hétig. A bélkárosodást 2% dextrán-nátrium-szulfáttal (DSS) indukálták ivóvízzel 5 napig. Az étrendi B12-vitamin változó szintjének hatását a bél mikrobiotájának összetételére az étrendi beavatkozás 0. és 28. napján gyűjtött székletminták 16S rRNS-génszekvenálásával, valamint a vastagbélgyulladás indukcióját követő 7 nappal a 38. napon értékeltük, amikor a vér és a vastagbél szöveteket is gyűjtöttek.

Eredmények: A diétás beavatkozásokra reagálva a betegségtől mentes állatok bél mikrobiotájának összetételében nem találtak jelentős változást. Ezzel szemben a DSS által kiváltott vastagbélgyulladás után> 30 nemzetség jelentősen megváltozott a B12-vitaminhiányos egerekben. A megváltozott B12 szintek nem gyakoroltak szignifikáns hatást az összetett betegség-aktivitás pontszámokra; a B12-hiányos étrend beadása azonban csökkent DSS-indukálta hámszövet károsodást eredményezett.

Következtetések: A B12-vitamin pótlása egészséges körülmények között nem változtatja meg a bél mikrobiota összetételét, de hozzájárul a mikrobiális válaszok differenciálódásához és a bél dysbiosisához a kísérleti vastagbélgyulladás indukcióját követően.

Bevezetés

A gyulladásos bélbetegség (IBD) magában foglalja a bélbetegségek spektrumát, beleértve a fekélyes vastagbélgyulladást és a Crohn-kórt (1), és krónikus, visszaeső és remitáló nyálkahártya-gyulladás jellemzi a bélrendszerben (2). Egyre több bizonyíték társítja az IBD kialakulását a bél mikrobiota csökkent mikrobiális sokféleségével (3) és az étrendi változásokkal (4) egy genetikailag fogékony gazdaszervezetben (5). Míg az IBD kialakulásának közvetlen oka még mindig nem teljesen tisztázott, a mikrotápanyagok hiányosságai általában az IBD-vel társulnak. Ebben a populációban az alultápláltság gyakran társul a nem megfelelő táplálékbevitelhez és az alapbélbetegség aktivitása miatti nem megfelelő felszívódáshoz. Ezért feltételezzük, hogy a mikrotápanyagok hiányosságai szerepet játszanak az IBD kialakulásában vagy progressziójában (6).

A B12-vitamin, más néven kobalamin, a metionin-szintáz koenzimjeként működik, amely katalizálja a homocisztein metioninná való átalakulását (7). A B12-vitamin hiánya hiperhomociszteinémiához vezet, amelyet magas homociszteinszint jellemez (8). A hyperhomocystiene a szív- és érrendszeri megbetegedések egyik megalapozott kockázati tényezője, és összefüggésben van az artériás fal merevségével (9), amely IBD-ben szenvedő betegeknél gyakran megnő (10). A hiperhomociszteinémia és az IBD összefüggését korábban már leírták (11), az IBD-s betegek bélszöveteiben (mind Crohn-betegség, mind fekélyes vastagbélgyulladás) emelkedett homociszteinszint volt, összehasonlítva az egészséges kontrollokból vett bélnyálkahártyával (12). A hiperhomociszteinémia foláthiányból is származhat, mivel a folát és a B12-vitamin egyaránt fontos kofaktora a metionin-szintáznak (13).

A B12-vitamin státusának a bélgyulladásra gyakorolt ​​hatásáról a mai napig ellentmondásos eredmények vannak, és egyetlen tanulmány sem vizsgálta, hogy a bél mikrobiomjának összetételében bekövetkező változások összefüggenek-e a B12-vitamin hiányával. Benight et al. (14) beszámolt arról, hogy a B12-vitamin-hiány megvédi az egerekben a DSS által kiváltott vastagbélgyulladást. Ezzel szemben Bressenot és mtsai. (15) a B12-vitaminhiányos patkányokban csökkent bélgát funkciót észlelt. Egy harmadik tanulmány eltéréseket talált az akut kobalamin beadásának hatásaiban az egér colitis modelljében annak bioaktív állapota alapján: a metil-kobalamin több gyulladáscsökkentő tulajdonsággal rendelkezik, míg a szintetikus cianokobalamin gyulladáscsökkentőbb hatású (16).

A gyomor-bél traktus a betegség elsődleges helye az IBD-ben, a specifikus régiókat a betegség altípusa alapján differenciáltan érintik. A gyomor-bél traktusban szintén több milliárd mikroorganizmus él, amelyek a bél mikrobiotájának nevezett komplex közösséget alkotják. A bél mikrobiota segíti a gazda immunrendszer fejlődését, az energia-anyagcserét és az enterális kórokozók elleni védekezést (17–19). A bél mikrobiómája számos nem fertőző, krónikus betegségben megváltoztatható (20), a táplálkozás jelentős hatással van a bél mikrobiotájára. Számos tanulmány jelzi, hogy az étrendi változások megváltoztathatják a bélmikrobák összetételét és működését (21). Ebben a tanulmányban ezért megvizsgáltuk az étrendi B12-vitamin változásainak hatását a nyálkahártya sérülésének súlyosságára és a széklet mikrobiota összetételére egér colitis modellben.

Anyagok és metódusok

Állatmodell

Az elválasztott három hetes C57BL/6 nőstény nőstényeket (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) a ​​Beteg Gyermekek Kórházának (Toronto, ON, Kanada, Kanada) laboratóriumi állatszolgálatának elszigetelő egységében helyezték el. Minden eljárást és protokollt betartottak, és azokat a Beteg Gyermekek Kórházának Állatgondozási Bizottsága jóváhagyta (37290. protokoll). Az egereknek szabad hozzáférést biztosítottak a chow-hoz és a steril ivóvízhez a vizsgálati protokoll alatt (1. ábra). Három Teklad diétát vásároltak a Harlan Laboratories Canada Ltd.-től. (Toronto, ON, Kanada). Mindhárom étrend a szokásos AIN-93G rágcsáló-étrend módosításából állt etanollal mosott kazeinnel a B12 háttér csökkentése érdekében: 1) elegendő B12-vitamin 50 mg/kg, 2) B12-vitaminhiányos 0 mg/kg és 3) B12-vitamin kiegészítve 200 mg/kg. A B12-vitamin (cianokobalamin) chow-koncentrációit az ENVIGO laboratóriumai (Madison, WI) mérték a besugárzás után, a hivatalos analitikai módszerek 952.20 és 960.46, AOAC INTERNATIONAL (Gaithersburg, MD) módszerével. Az összes étrendet egyeztettük a makrotápanyagok összetételével és energiatartalmával (18,3% fehérje, 60,1% szénhidrát, 7,0 tömeg% zsír, 3,8 Kcal/g).

1.ábra. A B12-vitamin beadásának kísérleti tervének grafikus ábrázolása dextrán-nátrium-szulfát (DSS) által kiváltott colitis egérmodellben. A három hetes C57BL/6 nőstény nőstényeket 4 héten át különféle B12-vitamint tartalmazó étrendekkel látták el. A DSS-t 5 napig adagoltuk, majd 2 napig csak vizet adtunk be. Székletpelletet kaptunk a 0., 28. és 38. napon. A vér- és vastagbélmintákat a 38. napon végzett áldozat idején gyűjtöttük össze.

Az egereket DSS kísérleti csoportba osztottuk ( = 15) és kontrollcsoport = 9). Mind a DSS kísérleti, mind a kontroll csoport egereit 3 ​​étrend-kezelési csoportra osztottuk: (1) elegendő B12-vitamin (2) hiányos B12-vitamin; (3) B12-vitamin kiegészítve. Megfelelő B12-vitamin-szinttel rendelkező kontrollcsoport felvételét vezették be annak érdekében, hogy értékelni lehessen a bél mikrobiomjában bekövetkező elmozdulásokat az anyatejből az egérsuhába való átmenethez viszonyítva. Az egereket lemértük, és a székletpelleteket a 0., a 28. és a 38. napon gyűjtöttük össze, hogy értékeljük a mikrobaközösségek változását. A DSS-t ivóvízben (2 tömeg/térfogat%, MP Biomedicals, Solon, OH) adtuk a 31. napon 5 napig csak a DSS kísérleti csoportnak, majd az állatok 2 napig csak vizet kaptak (22). Az állatokat nyomon követtük a súly, az egészség és a jó közérzet változásai, valamint a kísérleti eljárás során rögzített variációk szempontjából.

A B12-vitamin szintjének elemzése a szérumban

Teljes vért nyertünk az arc vénájából a 29. napon, két nappal a kolitisz DSS-indukciója előtt. A vérmintákat 2300 x g-vel, 4 ° C-on 20 percig centrifugáltuk, a szérumot elkülönítettük és -20 ° C-on tároltuk. A B12-vitamin szintjét kvantitatív módon mértük a Chemiluminescent Micropicle Intrinsic Factor assay (ARCHITECT B12 assay; Abbot Park, IL) alkalmazásával.

A hámkárosodás értékelése

A vizsgálati protokoll végén az állatoknak CO2-t adtak a nyaki diszlokáció előtt, a kettőspontokat kivágták és a hosszakat megmérték ex-korpusz. A disztális vastagbél szegmenseit 10% semleges pufferelt formalinba és paraffinba ágyazva rögzítettük. Ezután a mintákat metszettük, hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük, és Leica DFC420 kamerával felszerelt (Leica, Dialux 22: Leica Systems, Willowdale, ON, Kanada) Leica DMI 6000B mikroszkóppal vizualizáltuk, amint azt korábban leírtuk (23). A szövetmetszeteket egy megvakult egyén értékelte és pontozta. A hisztopatológiát számszerűen osztályozták a betegség aktivitási pontszámaival (DAS), amely a hámszöveti sérülés súlyosságának kombinált pontozásából állt (0–3 fokozatú, hiányzástól enyheig, beleértve a felszíni hámkárosodást, közepes fokú, beleértve a fokális eróziókat, és súlyos, beleértve a multifokális eróziót is), a gyulladásos sejtek beszivárgásának mértéke (0–3 fokozatú, a hiányzástól a transzmurálissá) és a serlegsejt-kimerülés (0–2 fokozatú, a serlegsejtek számának változása és a látható serlegsejtek változása nélkül), a korábban leírtak szerint (24).

Immunfluoreszcencia

A vastagbélszövetekben a Muc2 termelés detektálását rögzített szakaszokon végeztük, a korábban leírtak szerint (25). Röviden, a vastagbélmetszeteket primer nyúl anti-Muc2-vel (Santa-Cruz, Dallas, TX) inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on, majd Alexa Fluor 488-konjugált szekunder (Invitrogen, Carlsbad, CA) és DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ) szobahőmérsékleten 2 órán át. A képeket egy Nikon TE-2000 digitális mikroszkóppal készítettük, amely egy Hamamatsu C4742-80-12AG kamerával volt felszerelve.

Fordított átírás QPCR

A teljes vastagságú disztális vastagbélmintákat az elpusztításkor összegyűjtöttük, és –80 ° C-on lefagyasztottuk. Az összegyűjtött szöveteket homogenizáltuk, és a teljes RNS-t Trizol-tal (Invitrogen) extraháltuk. Az izolált RNS-t DNase A-val (Invitrogen) kezeltük, a gyártási irányelvek szerint. Az RNS minőségét és hozamát A260/A280 és A260/A230 arányokkal értékeltük és Nano-Drop® ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies) elemeztük. Összesen 1 μg RNS-t írtunk át cDNS-be, iSCRIPT cDNS szintézis készlet (Bio-Rad) felhasználásával. A cDNS-t qPCR segítségével amplifikáltuk SsoFast EvaGreen Supermix és CFX96 C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad) felhasználásával. Az egér GAPDH és az riboszomális fehérje L10 (RPL10) (háztartási gének), az interleukin-10 (IL10) és a tumor nekrózis faktor a (TNF-a) elleni primereket használtuk. A vizsgálatban használt alapozó szekvenciákat az 1. kiegészítő táblázatban találhatjuk. Az összehasonlító ddCt-módszert alkalmaztuk az endogén referenciákra (GAPDH és RPL-10) normalizált célgén mennyiségének és a kontrollcsoportban alkalmazott kalibrátorhoz viszonyítva.

16S rRNS génelemzés

Statisztikai elemzések

A 16S rRNS szekvenálási adatok összes statisztikai elemzését az R 3.5.2 változatban hajtottuk végre (33). A teljes összeg-skálázás normalizálását a kezelési csoportokon belüli nemi szintű adókülönbségek értékelése előtt végeztük kétoldalas párosítatlan permutációs t-teszt alkalmazásával, és a többszörös összehasonlításhoz korrigáltuk a Benjamin Hochberg-eljárással (FDR). A kezelési csoport között a relatív bőség elemzését Kruskal Wallis teszt alkalmazásával értékeltük és FDR-rel korrigáltuk. Permutációs többváltozós varianciaanalízist (PERMANOVA) alkalmaztunk a béta diverzitásbeli különbségek értékelésére. Az összes többi szignifikancia tesztet a Graphpad-on hajtottuk végre, vagy Student t-tesztjével, vagy ANOVA-val Tukey-vel poszt-hoc tesztelés, 0,05). Ezzel szemben a B12-vitaminhiányos egerek mutatták ki a legjelentősebb taxonváltozásokat, 39 taxon jelentősen megváltozott a DSS-nek való kitettség után (FDR Kulcsszavak: B12-vitamin, gyulladás, mikrobiom, gyulladásos bélbetegség, vastagbélgyulladás

Idézet: Lurz E, Horne RG, Määttänen P, Wu RY, Botts SR, Li B, Rossi L, Johnson-Henry KC, Pierro A, Surette MG és Sherman PM (2020) B12-vitamin-hiány megváltoztatja a bél mikrobiotáját egy rágcsálómodellben a vastagbélgyulladás. Elülső. Nutr. 7:83. doi: 10.3389/fnut.2020.00083

Beérkezett: 2020. március 06 .; Elfogadva: 2020. május 07 .;
Publikálva: 2020. június 05.

Silvia Turroni, Bolognai Egyetem, Olaszország

Nobuhiko Kamada, Michigani Egyetem, Egyesült Államok
Ravinder Nagpal, Wake Forest Orvostudományi Kar, Egyesült Államok

† Jelenlegi címe: Eberhard Lurz, Gasztroenterológiai és Hepatológiai Osztály, Gyermekgyógyászati ​​Klinika, Dr. von Hauner Gyermekkórház, Egyetemi Kórház, LMU München, München, Németország

‡ Ezek a szerzők megosztották az első szerzőt