Retinol-kötő fehérje 4 az emberi elhízás cukorbetegségében
Absztrakt
KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK
Klinikai vizsgálat.
Az intézményi vizsgabizottság jóváhagyta az összes vizsgálatot (keresztmetszet, súlycsökkentés, mikrodialízis és in vitro adipogenezis), és minden alany előzetes írásbeli beleegyezését adta. A kaukázusi menopauzás nők korábban leírt (10) populációjából keresztmetszeti vizsgálatban összehasonlítottuk a sovány, túlsúlyos és elhízott menopauzás nőket. A súlycsökkentő vizsgálatban 30 kaukázusi menopauzás nő kezdte el az étkezési súlycsökkentő protokollt, és tanácsot kaptak az energiafogyasztás 600 kcal/nap-os csökkentésére, amint azt korábban leírták (11). Tizenhét nő érte el az 5% -os súlycsökkentési célt 13 hét után, és bevonták őket a zsírszövet génexpressziójának és a szérum RBP4 elemzésébe. Mindkét vizsgálatban egyetlen résztvevő sem volt cukorbeteg, vagy vese- vagy májbetegségben, pangásos szívelégtelenségben vagy koszorúér-betegségben szenvedett. A hormonpótló kezelést 4 héttel, az összes többi gyógyszert 1 héttel a vizsgálatok előtt abbahagyták. A résztvevők a vizsgálat megkezdése előtti 3 hónapban nem változtatták testtömegüket> 1 kg-mal. 9:00 órakor antropometriai méréseket és vérmintákat nyertünk. egyéjszakás böjtöt követve. A periumbilicalis szubkután zsírszövetet tűbiopsziával állítottuk elő az előzőekben leírtak szerint (10,11).
Mikrodialízis vizsgálat.
In vitro adipogenezis vizsgálat.
Az emlő szubkután zsírszövetét egészséges nőkből (BMI 25–30 kg/m 2, 35–58 évesek) állították elő mellkisebbítő műtéttel az emberi zsírsejtek izolálása céljából. A stromavascularis sejteket és az érett adipocitákat kollagenáz emésztéssel izoláltuk, és egy éjszakán át szérumtartalmú táptalajban tenyésztettük, ahogy azt korábban leírtuk (13). Az RBP4 génexpresszió összehasonlítása céljából a teljes RNS-t izoláltuk a stromavascularis sejtek és az egyes donorok érett adipocytáinak párosított mintáiból 1 további tenyésztési nap után, szérummentes körülmények között. A stromavascularis sejtekben az adipogenezist inzulin, izobutil-metil-xantin, kortizol és trijód-tironin koktél indukálta, a korábban leírtak szerint (13). Az RBP4 táptalajba történő szekrécióját összehasonlítottuk a stromavascularis sejtekkel és a differenciálódott adipocitákkal a 12. napon az adipogenezis indukciója után.
analitikai módszerek.
A preadipocitákból, adipocitákból és zsírszöveti biopsziákból származó teljes RNS-t a Qiagen RNeasy mini készlet segítségével izoláltuk (beleértve az RNáz-mentes DNáz készletet; Qiagen, Hilden, Németország). Az RBP4 és GLUT4 génexpressziót az ABI 5700 szekvencia detektáló rendszerrel valós idejű PCR-hez (PE Biosystems, Weiterstadt, Németország) a standard görbe módszerrel határoztuk meg, és endogén kontrollokkal normalizáltuk, így tetszőleges egységeket (AU) kaptunk (13). Előkevert vizsgálati igények humán RBP4, GLUT4, glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) és 18S rRNS-ekhez (PE Biosystems, Weiterstadt, Németország), amelyek előkevert primereket és fluoreszcensen jelölt próbákat tartalmaznak. A GAPDH (1,1%), a 18S rRNS (0,9%), az RBP4 (1,3%) és a GLUT4 (1,4%) vizsgálati interakciós variációs együtthatóit laboratóriumunk standardizált emberi zsírszövet-cDNS-ével határoztuk meg.
A szérummintákban az RBP4-et kompetitív enzimmel kapcsolt immunszorbens assay-vel (ELISA) (AdipoGen, Szöul, Korea) mértük a standard görbe módszerrel, a rendelkezésre álló humán RBP4 minta hígítási sorozatával (R 2 = 0,99 a standard görbe lineáris regresszióhoz) ). Interassay CV (a gyártó által minden lemezhez biztosított kontroll segítségével mérve) 8,4% volt; intra-assay CV (minden lemezen hat azonos szérum minta mérése) 5,3% volt.
A vér lipidjeit, a glükózt és az inzulint minősített laboratóriumban mértük. A véráramlás változását az etanol hígítási technikájával és Fick elvével határoztuk meg. A kiáramlás/beáramlás arányának (etanol arány) csökkenése egyenértékű a véráramlás növekedésével és fordítva. Az etanolt standard enzimes vizsgálattal mértük (14). A dializátum glükóz és laktát koncentrációját a CMA/600 analizátorral (CMA Microdialysis) mértük. A zsírszöveti dializátumok glükóz és laktát in situ visszanyerése ~ 30% volt (12).