A marhahús-, csirke- és szójafehérjék az étrendben különböző bélmikrobiotákat és metabolitokat váltanak ki

Élelmiszer mikrobiológia

Szerkesztette
Javier Carballo

Vigo Egyetem, Spanyolország

Felülvizsgálta
Maria D. Serradell

Nemzeti Befektetési és Műszaki Beruházási Tanács (CONICET), Argentína

Jinshui Zheng

Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Kína

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

szójafehérjék

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • A húsfeldolgozás és a minőségellenőrzés legfontosabb laboratóriuma, MOE, A húsfeldolgozás kulcsfontosságú laboratóriuma, MOA, Jiangsu Hústermelés, Feldolgozás és Minőségellenőrzés Együttműködő Innovációs Központja, Nanjing Mezőgazdasági Egyetem, Nanjing, Kína

Bevezetés

Az utóbbi években a hús és húskészítmények túlzott bevitele összefüggésbe hozható néhány anyagcserezavarral (Tilman és Clark, 2014). Pontosabban, a vörös hús magas hőmérsékleten történő főzése során keletkezett N-nitrozovegyületek és heterociklusos aminok kritikus tényezők lehetnek a vastagbélrák okozta halálozás megnövekedett kockázatának szempontjából (Pan et al., 2012; Bastide et al., 2015) . Ugyanakkor az a tény, hogy a húsnak számos biológiai funkciója van a magas biológiai hozzáférhetőségű tápanyagok tekintetében, beleértve az esszenciális aminosavakat, a hem vasat és a vitaminokat (Pereira és Vicente, 2013).

Az étel olyan fő tényező, amely alakíthatja a bél mikrobiotáját (Subramanian et al., 2014). A gyomor-bél traktusról és a rezidens baktériumokról kimutatták, hogy döntő szerepet játszanak az étrendi összetevők kivonásában és metabolizálásában (Muegge et al., 2011; Tyakht et al., 2012; Tang et al., 2013). Naponta körülbelül 12–18 g fehérje jut be az emberi vastagbélbe, amely maradék étkezési fehérjékből és a vékonybélben szekretált endogén enzimekből áll (Scott és mtsai., 2013). A bevitt fehérjék hozzávetőlegesen 10% -a eljuthat a vastagbélbe, ami az elfogyasztott fehérje típusától és mennyiségétől függ (Cummings, 1997). A maradék étkezési fehérjék és az endogén enzimek jelentik a fő nitrogénforrást a bél mikrobiota növekedésében (Cummings és MacFarlane, 1991). Az aminosavak energiaforrássá válnának a disztális vastagbélben (Hamer et al., 2012). A legújabb vizsgálatok azt mutatták, hogy a bél mikrobiotájából származó metabolitok bizonyos hatással lehetnek a gazdaszervezet egészségére, például a rövid láncú zsírsavak, különösen a butirát szolgálhatnak energiaként a gazdaszövetek számára (Flint és mtsai, 2015). Másrészt a lipopoliszacharid (LPS), egy endotoxin, bejuthat a keringésbe és a májban lipopoliszacharid-kötő fehérjéhez (LBP) kötődhet (Weiss, 2003; Zhao, 2013). Az LPS-LBP komplex tovább kötődik a CD14 receptorhoz, amely közvetíti a makrofágok aktivációját gyulladásos citokinek előállítására (Lukkari et al., 1999).

Anyagok és metódusok

Állatok és minták

Négy hetes hím Sprague-Dawley patkányokat (117 ± 10 g) a Zhejiang Kísérleti Állatközpontból (Zhejiang, Kína, SCXK9 2008-00) vásároltak, és egy meghatározott kórokozóktól mentes állatközpontban helyezték el (SYXK 2011-0037) . 7 napos akklimatizáció után (fehérjeforrás: kazein) a patkányokat véletlenszerűen négy, kazeinnel és marhahúsból, csirkéből és szójaból származó fehérjéhez rendelték ( = 8 csoportonként). A kazein az egyedüli fehérje az Amerikai Táplálkozástudományi Intézet által ajánlott standard patkánytáplálásokban, ezért a kazeincsoportot állítottuk be kontrollként. A megfogalmazott étrendeket a korábban leírtak szerint készítettük el (Zhu et al., 2015). Az állatokat külön-külön műanyag szellőztetett ketrecekben tartottuk, és vizet adtak nekik és táplálékot kaptak ad libitum hőmérséklet és páratartalom (20,0 ± 0,5 ° C, 60 ± 10%) ellenőrzött helyiségben, 12 órás világos/sötét ciklussal. Az állatokon végzett kísérleti protokollt a Nanjing Mezőgazdasági Egyetem Kísérleti Állatközpontjának Etikai Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta. Valamennyi kísérletet a Nanjing Agráregyetem Kísérleti Állatközpontjának Etikai Bizottsága vonatkozó irányelveinek és előírásainak megfelelően hajtottuk végre.

90 napos etetés után az összes patkányt 4 óra éhezés után felöltük. A disztális vastagbél tartalmát összegyűjtöttük és két eppendorf csőbe helyeztük, majd azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és -80 ° C-on tároltuk a metabolomikus és mikrobiotikus elemzésekhez.

Mikrobiota és metabolikus elemzés

A mikrobiota elemzésre korábbi tanulmányunkra hivatkoztunk (Zhu et al., 2015). Röviden, a vakbél tartalmát összegyűjtöttük, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és elemzésük előtt -80 ° C-on tároltuk. Az egyes mintákból DNS-t nyertünk ki a QIAamp DNS Stool Mini Kit (NO. 51504, Qiagen, Németország) segítségével a gyártó protokollja szerint. A vakbél tartalmából származó 16S riboszomális RNS (rRNS) gént univerzális primerekkel amplifikáltuk: F515 (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3 ′) és R907 (5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3 ′). Az amplifikációhoz a V4-V5 hipervariábilis régiót alkalmaztuk, amely szinte minden baktérium taxon számára univerzális. A megtisztított amplikonokat a MiSeq platform alatt (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA) szekvenáltuk egy kereskedelmi vállalat (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd, Shanghai, Kína) szabványosított protokollja szerint.

Fordított transzkriptáz-polimeráz láncreakció (RT-PCR) alapú mRNS vizsgálat

Félkvantitatív RT-PCR vizsgálatot alkalmaztunk az LBP és CD14 mRNS-szintjének becslésére a májmintákban. A teljes RNS-t májmintákból izoláltuk TaKaRa MiniBEST Universal RNS Extraction Kit (TaKaRa, Japán) alkalmazásával, a gyártási protokoll szerint. A teljes RNS-t NanoDrop ND-2000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Delaware, USA) számszerűsítettük 260/230 és 260/280 nm-en. Ezután 400 ng RNS-t fordítottak át 10 μl cDNS-be a PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa, Japán) és a Peltier Thermal Cycler 200 (MJ Research, Watertown, MA, USA) segítségével. A cDNS-t RNáz-mentes vízben oldjuk és -20 ° C-on tároljuk.

A kétlépcsős qRT-PCR reakciókat három példányban, 96 lyukú lemezeken hajtottuk végre, 7500 valós idejű PCR-rendszert (Applied Biosysytems, Foster, CA) a SYBR® Premix Ex TaqTM (TaKaRa, Ostu, Japán) alkalmazásával. Az LBP-t (Lukkari és mtsai, 1999), a CD14 (Järveläinen és mtsai, 1997) és a β-aktin primer szekvenciákat Sangon Biotech (Shanghai, Kína) szintetizálta. Ezeket a példa szekvenciákat az 1. táblázatban soroltuk fel. A templát és a primerek koncentrációját, az LBP, a CD14 és a β-aktin amplifikáció hatékonyságát és konzisztenciáját egy relatív standard görbével értékeltük echelon hígítással (1: 1–1: 625). A reakcióoldat (20 μL) 10 μL SYBR® Premix Ex Taq-ot, 0,4 μL PCR előremozdítót (10 μM) és 0,4 μL PCR tartalék primert (10 μM), 0,4 ROX referencia festéket II, 2 μl cDNS-t és 6,8 μl dH2O-t tartalmaz. A kerékpáros körülmények a következők voltak: 30 másodperc denaturálásnál 95 ° C-on, 40 ciklus 5 másodpercig 95 ° C-on és 34 másodperc 60 ° C-on denaturálásig, majd háromszoros váltakozás 95 és 60 ° C között az olvadási görbe elemzéséhez az igazolás érdekében egyetlen amplifikáció sajátossága. Az LBP és CD14 expressziójának változásait a 2 -ΔΔCt módszerrel számítottuk, normalizálva a β-aktinra, szójafehérje csoportot állítva kontrollként.

Asztal 1. QRT-PCR-hez használt primerek

Western Blotting

Statisztikai elemzések

Lineáris diszkrimináns elemzést (LDA) és hatásmérést (LEfSe) párosítva végeztünk (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/), hogy felfedezzük a nagydimenziós bélbaktériumokat és jellemezzük a két vagy több biológiai állapot közötti különbségeket ( vagy osztályok; Segata és mtsai, 2011; Zhu és mtsai, 2015). A különböző jellemzőket az OTU és a nemzetség szintjén azonosították.

Többváltozós elemzéseket végeztünk a SIMCA-P szoftverrel (11.5 verzió), hogy megkülönböztessük a vastagbél tartalmú metabolitokat. A főkomponens-elemzést (PCA) és a részleges legkisebb négyzetekkel megkülönböztető elemzést (PLS-DA) az NMR-adatokon végeztük. A PLS-DA modelleket ötszörös keresztellenőrzéssel alkalmaztuk, és az R 2 X és Q 2 értékekkel értékeltük. A modelleket egy permutációs teszttel (200 permutáció) tovább validáltuk. A látens szerkezetre vetített ortogonális vetítés (OPLS) modellben az X mátrix az egyes minták összes metabolitjának koncentrációját képviseli, az Y mátrix pedig az egyes minták csoportinformációit. Szűrheti az adatok zaját, és megkülönböztetheti a két csoport közötti különbséget (Trygg és Wold, 2003), ezért előkészítették, hogy maximalizálja a két csoport közötti elválasztást. A metabolitokat az 1-nél több és a statisztikailag szignifikáns változás alapján a projektációs (VIP) pontszámok változó fontossága alapján differenciáltukt-teszt, 1H-NMR-spektrometria (1. kiegészítő táblázat), amely 22 aminosavat, 7 rövid láncú zsírsavat, 8 cukrot, 4 fenolsavat, 4 amint, 2 alkoholt, 2 aminosavszármazékot, 2 ketont, 5 nukleinsav-komponenst, 9 egyéb szerves savak, 1 vitamin/kofaktor és kolin.

Az alapkomponens-elemzés a metabolitokban nagy csoportokon belüli és csoporton belüli variációkat tárt fel (1. ábra). A csirke fehérje csoportja jól el volt különítve a kazein, marha és szója fehérje csoportoktól, ami azt jelzi, hogy a vastagbél metabolitjai különböző válaszokat mutattak a csirke fehérjére az étrendben ( X mátrixként 1H-NMR-spektrum adatot, a próbabábu Y mátrixaként pedig osztályozási információkat használtunk. Az OPLS diagram megmutatta, hogy a vastagbél poláris metabolitjainak profilja szignifikánsan különbözik egymástól (3. ábra). A kazein és a másik három fehérje csoport között a legjobb 15 VIP pontszámmal rendelkező felelős változókat a 3. ábra mutatja be. A kazein csoporthoz képest a marhahús fehérje csoport alacsonyabb glükóz-, ribóz-, galaktóz-, butirát-, propionát-, uracil-, alaninszintet mutatott., de magasabb a szukcinát és a laktát koncentrációja. A csirke fehérje csoportban magasabb volt a laktát, de alacsonyabb a galaktóz, az uracil, a butirát, a ribóz, a propionát és a glükóz mennyisége. A szójafehérje csoportban magasabb volt a szukcinát, a glükóz, a propionát, a laktát és a butirát, de alacsonyabb a leucin, xantin, valin, uracil, ribóz, glutamát és alanin.

3. ábra. A vastagbéltartalom páros összehasonlítása a marhahús-, csirke- és szójafehérje-csoportokból nyert spektrumok OPLS-analízissel történt. Minden ábrának két része van: a bal rész OPLS pontszámdiagram, a jobb rész a top 15 VIP pontszám. (A) marhahús fehérje csoport vs. kazeincsoport; (B) szójafehérje csoport vs. kazeincsoport; (C) csirke fehérje csoport vs. kazein csoport.

A bélmikrobiota különös választ adott az étrendi fehérjékre

Általános információ

A 32 vastagbélmintának összesen 998 150 használható nyers leolvasása volt, átlagosan 31 192 ± 4955 leolvasással (Kiegészítő 1A. Ábra). A leolvasott értékeket 837 működési taxonómia egységbe (OTU) osztották be, mintánként átlagosan 380 ± 70, 97% -os hasonlósági szinten (1B. Kiegészítő ábra). Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget az olvasások során bármely két étrendcsoport között (o > 0,05), de a marhahúsfehérje-csoport nagyobb számú OTU-t tartalmazott, mint a kazein- és csirkefehérje-csoportok (o 0,05, 2. kiegészítő táblázat) négy csoport között az ACE, Chao, Shannon, Simpson és Good bélmikrobiota lefedettségi indexeiben.

Diéta hatása

Az alapkomponens-elemzés nagy vastagbél-baktériumok közötti jelentős különbségeket tárt fel az étrendcsoportok között (4. ábra). A csirke fehérje csoport jól elkülönült a kazein, a marha és a szója fehérje csoportoktól a PC 1-ben, míg a csirke és a marha fehérje csoportok elkülönültek a kazein és a szója fehérje csoportoktól a PC 2-ben. Az eredmények azt mutatják, hogy a bélbaktériumok eltérő válaszok a csirkefehérjére az étrendben, a kazein, marhahús fehérje és szójafehérje. A szója- és kazeinfehérje-csoportok nagy hasonlóságot mutattak. Menekültügyi szinten (5. ábra), Firmicutes és Bacteroidetes a négy csoportban a két legelterjedtebb phyla volt, ami a kazein-, marha-, csirke- és szójafehérje-csoportok variációinak 83,5, 75,5, 85,6 és 81,2% -át tette ki. A csirke fehérje csoportban volt a legnagyobb a bőség Bacteroidetes, de a legkisebb bőség Firmicutes. A bélbaktériumok klaszteranalízise a menedékjogi szinten azt mutatta, hogy a marhahús, a kazein és a szójafehérje csoportokból származó bél mikrobiota ugyanabba az alosztályba sorolható, amely el volt választva a csirke fehérje csoportéval.

4. ábra. A PCA pontozza a patkányok bél mikrobiotáját, különféle étrendi fehérjékre reagálva. Minden pont egy biológiai mintát jelent.

5. ábra. A bél mikrobiotájának relatív bősége a menedékjog szintjén. A kördiagram a bél mikrobiota összetételét mutatja a menedékjog szintjén. A klaszterelemzés azt mutatja, hogy a marha- és szójafehérje csoport bélmikrobiotája ugyanabba az alosztályba sorolható és elválasztható a csirkefehérje csoporttól.

A LeFSe elemzést OTU szinten végeztük, hogy azonosítsuk a különféle étrendcsoportok specifikus baktériumait. A kazeincsoporthoz képest 96 differenciális OTU volt (6. ábra). Ezen OTU-k közül 16, 12 és 40 OTU volt magasabb a marha-, csirke- és szójafehérje-csoportokban, ennek megfelelően 15, 32 és 18 OTU alacsonyabb volt a fenti három csoportban. Különösen a csirke fehérje csoportban volt a legnagyobb relatív OTU-mennyiség a nemzetségnél Lactobacillus (OTU427 és OTU746), míg a szójafehérje csoportban volt a legmagasabb a relatív OTU-mennyiség a családban Ruminococcaceae.

6. ábra. Bélbaktériumok OTU szinten válaszul az étkezési fehérjékre LefSe alkalmazásával. (1) A bal rész az OTU és a megfelelő phyla, családok és nemzetségek jelentős különbségét sorolja fel; (2) A középső hőtérkép minden OTU gazdag és szegény csoportját mutatja; (3) A megfelelő hőtérkép az OTU relatív bőségét mutatja (log 10 transzformálva). Minden oszlop egy biológiai mintát és minden sor egy OTU-t képvisel.

Az étrendi fehérjék befolyásolják a bélből származó endotoxin szintet a májban

Az LPS, bélből származó endotoxinok, a májban képesek kötődni az LBP-hez, és a CD14 receptoron keresztül aktiválhatják a Kupffer-sejteket. Gyulladásgátló citokinek szabadulnak fel, és ezt feltételezik a májkárosodás elősegítésére.

Nem találtunk szignifikáns különbséget az LBP mRNS szintjén az étrendi csoportok között ( > 0,05, 7A. Ábra). A CD14 mRNS szintje azonban szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult a kazein, marha és csirke fehérje csoportokban, mint a szójafehérje csoport ( 0,05, 8. ábra).

7. ábra. Az LBP génexpressziós szintje (A) és CD14 (B) a májban. Az összes mRNS mennyiségi meghatározási adatot normalizáltuk a háztartásgén β-aktinnal. A génexpressziós szinteket a szójafehérje csoporthoz viszonyított értékekben fejeztük ki. A különbözõ feliratokkal rendelkezõ eszközök jelentõsen eltértek ( szójafehérje csoport> marhahús fehérje csoport (Xuebin Shi, személyes kommunikáció). Ez az eredmény azt mutatta, hogy a csirke fehérje könnyebben emészthető és felszívódó a vékonybélben, mint a szója és a marhahús fehérje, ami miatt kevés aminosav került a vastagbélbe (Christensen, 1984). Harmadszor, a bélhám felszívódási aktivitása hatással lehet az aminosavak szintjére (Zhao et al., 2011). Ezért a marha- és szójafehérjék kevésbé emészthetők és felszívódhatnak a vékonybélben, és módosíthatják a vastagbélben lévő bélbaktériumok összetételét, ami magasabb vastagbéltartalmú aminosavszintet eredményez. Az alapul szolgáló mechanizmus további vizsgálatokat igényel.

2. kiegészítő ábra. A glutation S-transzferázok expressziója a májban.

3. kiegészítő ábra. Különböző táplálékfehérjéket tápláló patkányok F/B aránya a, b, A különböző betűkkel rendelkező eszközök jelentősen eltértek egymástól ( Kulcsszavak: NMR, bél mikrobiota, vörös hús, fehér hús, metabolitok

Idézet: Zhu Y, Shi X, Lin X, Ye K, Xu X, Li C és Zhou G (2017) Marha-, csirke- és szójafehérjék az étrendben különböző bélmikrobiotákat és metabolitokat indukálnak patkányokban. Elülső. Microbiol. 8: 1395. doi: 10.3389/fmicb.2017.01395

Beérkezett: 2017. március 20 .; Elfogadva: 2017. július 10 .;
Publikálva: 2017. július 27.

Javier Carballo, Vigo Egyetem, Spanyolország

Maria de los Angeles Serradell, Centro Científico Tecnológico CONICET La Plata és Universidad Nacional Arturo Jauretche, Argentína
Jinshui Zheng, Huazhong Mezőgazdasági Egyetem, Kína